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            3D細胞培養的現狀及未來

            發布時間: 2022-02-21  點擊次數: 1902次
            2D細胞培養作為一項生命科學領域中長期使用的技術,使人類能夠在體外研究細胞的生理和病理。然而隨著對細胞微環境概念的逐漸了解,科學家們發現2D培養細胞的生理狀態和活性與體內細胞并不*一致,其結果常常與動物實驗和臨床實驗結果相矛盾。因此,在過去的十年中,科學家致力于開發各種3D細胞培養技術,以為細胞提供更類似于體內環境的培養環境。研究人員逐漸意識到,若想在體外實現細胞的形態、結構和生理功能,3D細胞培養需要能夠模擬包括細胞與細胞,細胞與細胞外基質及細胞與器官的相互作用在內的體內環境的關鍵特征。那么3D細胞培養技術如何能像2D細胞培養技術一樣推而廣之呢?

             


            去年,浙江大學醫學院孫苗醫師、劉安醫師為共同第一作者、浙大賀永教授、王慧明教授為共同通訊的綜述“3D cell culture—can it be as popular as 2D cell culture?”發表在《Advanced Nanobiomed Research》雜志。文章概述了以水凝膠系統為核心的生物材料系統、以生物打印為主要手段的生物制造技術及由微流控芯片和生物反應器構成的培養設備系統三個方面相關的3D細胞培養系統的開發。探討了3D細胞培養的現狀及未來,提出3D細胞培養在將來與2D培養一樣普及的關鍵可能在于其制造、培養操作及檢測的標準化,這其中涵蓋了多種技術難題。

            作者首先從培養基質、細胞極性、生物因子擴散、微環境四方面對2D,2.5D與3D細胞培養的差異進行了比較,并作出了示意圖。(表1)

            表1 2D,2.5D,3D細胞培養對比
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            為了真正實現體內細胞的形狀和功能,科學家引入了一種基于水凝膠的ECM系統。水凝膠中存在的3D網絡結構使液體可以在其中擴散或滲透,從而為細胞提供了良好的生長環境。這種基于水凝膠的培養底物系統是整個3D細胞培養系統的核心。作者將3D細胞培養的所需的技術支持以塔表現出來。(圖1)

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            圖1 三維細胞培養示意圖。當我們把三維細胞培養看作是一座建筑塔時,生物材料的ECM模擬、微結構的制造和培養體系構成了整個塔的支柱,支撐著第一級的屋頂——三維細胞培養的應用。隨著3D細胞培養技術的發展,塔的第二層展示了我們所面臨的挑戰。只有攻破這些挑戰,才能最終達到3D細胞培養的塔尖。
             

             

            3D培養的生物材料:

            1.水凝膠

             

            水凝膠是一種有效的3D細胞培養基質,它由交聯的聚合物鏈或復雜的天然或合成蛋白質分子網絡組成。由于存在大量水,水凝膠的生物物理特性與天然組織的生物物理特性非常相似。作者對3D細胞培養中常用的不同類型的水凝膠及其性質進行了總結。(表2)

            表2  水凝膠的性質
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            用于3D細胞培養的水凝膠需具有多孔性且孔間相互連通,孔徑應與目標組織的細胞大小匹配。此外,在物理性質上,由于來自不同組織類型的細胞需要生長基質的不同機械性能,其彈性模量應與目標組織相匹配。水凝膠還應具有生物相容性和可降解性,可為細胞和促進細胞分化的官能團提供附著位點。同時,它在保持液態的同時需具有可成形性,在物理或化學交聯后能保持其形狀,為細胞提供穩定微環境。(圖2)

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            圖2 3D細胞培養所需要的水凝膠的性質
             

             

            2. 脫細胞基質

             

            通過脫細胞技術處理不同類型的組織和器官,可以獲得脫細胞的支架。此種支架不含細胞和遺傳物質,但可以保留復雜的超微結構并模仿靶組織的自然生理解剖結構,促進定植的干細胞分化為目標組織。但是,殘留的免疫原性物質和較低的機械強度阻礙了其在體內的應用。

             

            3. 其他細胞支持材料

             

            聚合物、金屬、陶瓷生物活性玻璃和碳纖維、納米管可制成各種形式的3D細胞培養支架,并與細胞包封材料組合使用。將纖維或顆粒添加到水凝膠中可以增加其強度,并充當細胞粘附的結構,進一步改善水凝膠的生物學特性。

            接下來,作者以本課題組的科研工作為例,概述了典型的仿生ECM制造。

            (1)澆鑄法:預先準備具有特定形狀的模具,將與細胞混合的水凝膠倒入后通過光、物理、化學等方法固化,從模具中取出后獲得培養單元。此種方法的缺點是制造大型結構時缺少內部通道,成型結構的營養供應和代謝廢物不足。而微成型允許生產具有多種復雜幾何形狀的小型結構。利用高流動性的水凝膠和柔軟的超細纖維霉菌(SUFM),自動輸送液體和細胞,并將細胞均勻地播種到超細通道中(500 nm至100μm)。

            (2)微球制造:利用表面張力以及水凝膠的粘度,使用懸滴法制造包裹細胞的微球。在靜電場下,可以制造微米級的球,用于高通量培養和檢測。

            (3)超細纖維制造:利用靜電紡絲或擠壓3D打印將水凝膠轉變為細絲,此種結構可用于神經組織。此外,大量的纖維可形成薄膜或涂層,由細絲的定向結構形成的支架也可以操縱細胞行為。

            (4)通道制造:可利用同軸3D打印、犧牲模板復制和DLP打印制造通道結構,用于模仿血管和呼吸道。同軸印刷制造的管堆疊形成的3D結構具有一定的直徑且沒有分叉,而DLP或犧牲模板復制可產生不同直徑的分叉結構和通道。

            (5)復合材料:結合不同的制造技術,可以制造具有復雜結構的培養單元以進一步模擬人體器官或組織。

            (6)生物3D打?。?/span>利用活細胞、細胞外基質、生物因子和生物材料作為制造生物產品的原料。當前3D生物打印的問題是打印精度和打印效率之間的矛盾:結構越精細,分辨率越高,打印效率就越慢。而裝載在生物墨水中的細胞難以承受長時間的打印過程。此外,剪切力、不穩定的物理和化學環境、反復的交聯過程都會影響產品的質量。

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            圖3 基于水凝膠材料的仿生ECM的典型制造過程
             

             

            3D細胞培養的應用

             

            3D細胞培養已成功應用于構建四種人體基本組織及多種組織構成的器官:大量的軟硬支架(生物陶瓷,羥基磷灰石和膠原蛋白)已被用來模仿骨骼組織并應用于臨床;微孔藻酸鈉細絲可用于模擬包裹神經細胞的神經纖維的結構;使用3D生物打印制作的內皮化的心肌在微流灌注生物反應器中培養后,心肌細胞定向正確,能夠自發并同步收縮;膠原蛋白凝膠和PCL膜已被用作在動物體內模型中重建角膜的細胞載體??墒褂?D細胞微球來研究腫瘤的發病機理和藥物篩選;骨、軟骨組織、心臟組織、皮膚和神經組織都已在動物實驗中獲得了再生應用;3D細胞培養也已證明可以顯著維持干細胞的結構和功能。

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            圖4 3D細胞培養在不同組織培養中的應用

             

            3D細胞培養的困難與挑戰

             

            (1)營養供應系統:
            在2D細胞培養中,定期更換培養基是2D細胞培養中用于營養供應和廢物代謝的方法。3D細胞培養的細胞密度和營養需求遠高于2D細胞培養,且培養單元內的細胞不與培養基直接接觸,僅通過擴散無法維持大量的物質代謝??刹捎霉嘧⑾到y或內部通道的制造來構建有效養分供應系統。

            灌注系統中,培養室與無驅灌注或微泵灌注裝置相連,培養室的另一端與廢液接收系統相連,以排出廢培養液。然而,灌注系統仍存在培養系統內存在靜水壓力和易發液體泄漏的問題。

            利用同軸3D打印技術,在培養單元內部建立管道系統以模擬人體的血液循環系統。這種方法從內部結構上改善了代謝物質的交換效率。此類管道被埋在培養單元中,并連接到灌注設備,以將營養物輸送到培養單元中。
             
            (2)檢測系統
            2D細胞培養時,細胞粘附在培養板上,可在顯微鏡下直接觀察,細胞染色和細胞內外物質提取過程中可直接用試劑代替培養基,操作過程方便。在3D細胞培養中,雖可使用共聚焦顯微鏡進行小樣品的檢測,但由于共聚焦顯微鏡視野和z軸掃描高度(200μm)的限制,培養過程中無法直接觀察到大體積的培養單位。因此,對于大型培養單位,科學家需要進行預處理,以細胞或組織的形式對其進行檢測。將水凝膠用化學試劑分解后,從中提取細胞或蛋白質,隨后用于ELISA、流式細胞儀、PCR、免疫印跡和其他分子生物學測試。

            (3)標準化
            在實驗研究中,隨機對照實驗是常用的統計分析方法。因此,大量穩定且可重復的樣本是確保研究結果可信度的基礎。除了樣品的標準化生產之外,培養條件的一致性也是干擾獲得的研究結果的主要因素。2D細胞培養技術使用常見的培養裝置和設備系統。標準化的設備和操作程序使不同研究人員生成的數據具有可比性,而不同實驗室建立的3D細胞培養系統的培養設備和樣品不相似,實驗數據難以對比。因此,建立模塊化培養系統,簡化培養操作并降低培養成本也是實現3D細胞培養所需要解決的問題。

            (4)結構可控的類器官
            近年來在腸和腦組織的3D細胞培養領域中,類器官已迅速發展。3D細胞培養的核心問題,即材料的生物學特性與成型特性之間的矛盾,在類器官的研究中變得越來越重要。細胞以3D方式生長時,需要通過3D微環境傳遞的力進行動態調節。軟培養基質可以傳遞這種力,但卻難以維持精細的結構,更難以精確控制培養基質中的多個細胞或細胞分布。未來的研究重點應放在通過物理調節來構造器官結構并將其與化學調節結合,以更好地誘導所產生的類器官的功能性的技術上。

            隨著生命科學領域的新發展,對3D細胞培養技術的需求正在急劇增加。將細胞封裝在水凝膠中建立3D細胞培養系統的優勢明顯,未來,3D細胞培養將逐步取代2D細胞培養,更好的反映細胞在體內的生長狀態。3D細胞培養技術的廣泛應用需要多學科技術之間的良好協調。首先是材料科學,其中高質量水凝膠培養基質的開發是3D細胞培養技術發展的基礎。其次,結合材料科學和生物制造技術的體內組織和器官的模擬為實現3D細胞培養提供了可能性。最后,微流體技術的發展可以整合培養和檢測功能,是實現片上芯片器官的重要手段。

             

             

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